DIRETRIZES PARA PESQUISA COM MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE
INSTITUTO DE QUÍMICA - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Estas diretrizes são baseadas nos "NIH Guidelines" - Guidelines for research involving recombinant DNA molecules e o "Manual de Segurança do Instituto de Química-USP".
Intenção das diretrizes
Especificar procedimentos seguros para manipular e descartar moléculas de DNA recombinantes, assim como organismos e vírus contendo moléculas de DNA recombinante (organismos geneticamente modificados - OGMs). Em cada laboratório, é responsabilidade do investigador principal garantir que estes procedimentos sejam adotados sempre que necessário.
Experimentos de DNA recombinante compreendidos nestas diretrizes
i/ Experimentos envolvendo organismo geneticamente modificado (OGM) de grupos de risco RG1, RG2, RG3 ou RG4.
ii/ Experimentos envolvendo a clonagem de toxinas com LD50 menor de que 100 nanogramas/kg peso corporal
iii/ Experimentos envolvendo animais inteiras
iv/ Experimentos envolvendo plantas inteiras
v/ Experimentos envolvendo mais de 10 litros de cultura
Procedimentos
Para cada experimento envolvendo moléculas de DNA recombinante:
1) Determinar o grupo de risco (RG1, RG2, RG3, ou RG4
2) Determinar o nível de contenção apropriado. Para experimentos de RG1, seguir as "Normas de Contenção e Segurança de Laboratórios de Bioquímica, Biologia Molecular e Microbiologia". Para experimentos de RG2, RG3 ou RG4, seguir os protocolos seguros e implementar os niveis de contenção adequados em acordo com os "NIH Guidelines - Guidelines for research involving recombinant DNA molecules". pode ser acessada pela internet: http://www.nih.gov/od/orda/toc.htm. Em caso de qualquer dúvida sobre o procedimento adequado, procure orientação de Comissão Interna de Biossegurança do Instituto de Química.
Grupos de risco
Agentes (moléculas de DNA recombinante e OGMs) são classificados segundo sua patogenicidade para humanos saudáveis segundo os seguintes critérios:
Grupo de risco 1 (RG1): Moléculas de DNA recombinante ou organismos geneticamente modificados (OGM) não associados com doenças humanas.
Grupo de risco 2 (RG2): Moléculas de DNA recombinante ou organismos geneticamente modificados (OGM) associados com doenças humanos que raramente são graves e que têm intervenções preventivas e terapêuticas..
Grupo de risco 3 (RG3): Moléculas de DNA recombinante ou organismos geneticamente modificados (OGM) associados com doenças sérias ou que têm intervenções preventivas e terapêuticas..
Grupo de risco 4 (RG4): Moléculas de DNA recombinante ou organismos geneticamente modificados (OGM) associados com doenças sérias ou fatais para as quais não existem intervenções preventivas ou terapêuticas.
Normas de Contenção e Segurança de Laboratórios de Bioquímica, Biologia Molécular e Microbiologia
As regras enumeradas a seguir constituem a base das práticas de contenção seguras de laboratório e podem ser estabelecidas como regulamentos de trabalho. São as regras mais importantes, às quais podem ser acrescentadas outras, muitas delas, específicas para cada laboratório onde se trabalha particularmente com determinado agente patogênico.
i/ não se alimente, não beba ou fume, não guarde alimentos e não aplique cosméticos no recinto de trabalho;
ii/ não pipete com a boca material infeccioso ou tóxico; proteja a ponta superior das pipetas com algodão antes de esterilização;
iii/ o laboratório deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer materiais que não tenham relação com o trabalho;
iv/ as superfícies de trabalho devem ser descontaminadas, pelo menos uma vez por dia e sempre que ocorrer caso de derramamento de substâncias potencialmente perigosos;
v/ deve ser desenvolvido no pessoal do laboratório o hábito de conservar as mãos longe da boca, nariz, olhos e rosto;
vi/ o pessoal de laboratório deve lavar as mãos depois de haver manipulado materias e animais infectados e também ao deixar o laboratório;
vii/ deve ser evitado o uso de barba e os cabelos compridos devem estar sempre presos quando se trabalhar com microorganismos perigosos;
viii/ todos os procedimentos devem ser efetuados de maneira a se evitar, ao máximo, a formação de aerossol;
ix/ as bancadas do laboratório devem ter a superfície muito lisa, de maneira a serem facilmente limpas e desinfetadas. As superfícies das bancadas devem ser recobertas com papel absorvente, sempre que exista a possibilidade de respingo de material perigoso;
x/ as subculturas de microorganismos infecciosos devem ser feitas em capelas;
xi/ todos os líquidos e sólidos contaminados devem ser descontaminados antes de eliminados ou reutilizados. Todos os animais recombinantes ou animais contaminados devem ser autoclavados antes de eliminados;
xii/ os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratório deverão ser acondicionados em recipientes fechados e impermeáveis;
xiii/ use sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratório; estas roupas não devem sair do recinto de trabalho e devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;
xiv/ sempre que for necessário, proteja os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando óculos de segurança, escudos faciais, máscaras ou qualquer outro dispositivo de segurança necessário;
xv/ somente deverão ser autorizadas a entrar no laboratório pessoas que tenham sido informadas sobre os possíveis riscos e satisfaçam os requisitos que se exigem para o acesso; durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente terão acesso ao local pessoas autorizadas; não se deve permitir a entrada de crianças no laboratório;
xvi/ não se deve permitir a entrada no laboratório de animais que não tenham relação com os trabalhos que estão sendo efetuados;
xvii/ as pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;
xviii/ em caso de respingos, cubra imediatamente a área com desinfetante adequado;
xix/ nunca umedeça rótulos com a língua; use água ou rótulos auto-adesivos;
xx/ use seringas e agulhas hipodérmicas somente para injeção; aspiração de líquidos de animais de laboratório e de vacinas contidas em frascos com tampas perfuráveis. Não as use para manipular líquidos infecciosos; nestes casos, devem ser empregadas pipetas automáticas;
xxi/ não empregue chumaços de algodão ao esvaziar uma seringa contendo ar ou excesso de líquido; neste caso, use um pequeno frasco cheio de algodão embebido em desinfetante;
xxii/ antes e depois de injetar materiais infecciosos em animais, esfregue o local da injeção com desinfetante;
xxiii/ utilize seringas com acessório especial para evitar que a agulha separe-se da seringa;
xxiv/ em todos os trabalhos nos quais existe possibilidade de contato direto acidental com sangue, material infeccioso ou animais infectados, devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;
xxv/ as centrífugas usadas para material tóxico ou infeccioso devem ser protegidas por anteparos;
xxvi/ use para centrifugação somente tubos não danificados e tampados. Tenha certeza de que o líquido contido no tubo não transbordará durante a centrifugação;
xxvii/ culturas líquidas de organismos altamente infecciosos requerem cuidados especiais, pois, qualquer movimento que agite a superfície do líquido , produzirá aerossol; os liquidificadores dão origem a pesados aerossóis;
xxviii/ os meios de cultura sólidos e ou líquidos utilizados para crescimento de bactérias devem ser autoclavados ou neutralizados antes de serem encaminhados ao lixo;
xxix/ amostras de soro sanguíneo de todo o pessoal do laboratório e demais pessoas expostas aos riscos a eles inerentes, devem ser conservadas como referência;
xxx/ todos os derramamentos, acidentes e exposições reais ou potenciais por material infectado devem ser imediatamente notificados ao chefe do laboratório;
xxxi/ o chefe do laboratório deve responsabilizar-se para que o pessoal receba uma formação apropriada sobre segurança no laboratório. O pessoal também deve ser informado sobre a existência se riscos especiais.
Apêndice A: agentes RG1
Agentes RG1 não são associados com doenças humanas e compreendem moléculas de DNA recombinante ou organismos que preencham os seguintes critérios:
A: Organismo receptor ou parental:
-não patogênico,
-isento de agentes adventícios,
-com amplo histórico documentado de utilização segura, ou com a incorporação de barreiras biológicas que, sem interferir no crescimento ótimo em reator ou fermentador, permita uma sobrevivência e multiplicação limitadas, sem efeitos negativos para o meio ambiente.
B: Vetor/Inserto:
-deve ser adequadamente caracterizado quanto a todos os aspectos, destacando-se aqueles que possam representar riscos ao homem e ao meio ambiente, e desprovido de sequências nocivas conhecidas.
-deve ser de tamanho limitado, no que for possível, às sequências genéticas necessárias para realizar a função projetada,
-não deve incrementar a estabilidade do organismo modificado no meio ambiente,
-deve ser escassamente mobilizável,
-não deve transmitir nenhum marcador de resistência a organismos que, de acordo com os conhecimentos disponíveis, não o adquira de forma natural.
C: Microorganismos geneticamente modificados:
-não-patogênicos,
-que ofereçam a mesma segurança que o organismo receptor ou parental no reator ou fermentador, mas com sobrevivência e/ou multiplicação limitadas, sem efeitos negativos para o meio ambiente.
D: Outros microorganismos geneticamente modificados que poderiam incluir-se no RG1, desde que reúnam as condições estipuladas no item C anterior:
-microorganismos construídos inteiramente a partir de um único receptor procariótico (incluindo plasmídeos e vírus endógenos) ou de um único receptor eucariótico (incluindo cloroplastos, mitocôndrias e plasmídeos, mas excluindo vírus),
-organismos compostos inteiramente por sequências genéticas de diferentes espécies que trocam tais sequências mediante processos fisiológicos conhecidos
