Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular. O Laboratório Tem Interesse em Dois Aspectos Distintos: (i) Controle Molecular dos Relógios Biológicos. Isolamento e Caracterização de Proteínas com Expressão Circadiana. (ii) Efeito da Poluição por Metais na Expressão de Proteínas em Algas Marinhas de Interesse Comercial. Controle Molecular dos Relógios Biológicos. Isolamento e Caracterização de Proteínas com Expressão Circadiana O objetivo a longo prazo do nosso projeto é elucidar os mecanismos moleculares, bioquímicos e celulares responsáveis pelos ritmos endógenos diários (circadiano). Todos os organismos têm um relógio biológico endógeno capaz de temporizar os mais diferentes processos fisiológicos e bioquímicos, tais como dormir/acordar, liberação de hormônios na corrente sanguínea, temperatura corpórea e função renal em mamíferos. Estes ritmos persistem sob condições constantes de luz e temperatura por várias semanas. Para nosso estudo, elegemos o dinoflagelado Gonyaulax polyedrasobre o qual há volumosa contribuição de diversos pesquisadores da área de cronobiologia. Esta célula mantida sob condições constantes apresenta a expressão circadiana de sua bioluminescência, divisão celular, fotossíntese e motilidade, os quais são controlados pelo relógio biológico. Nosso grupo de pesquisa está interessado no comportamento de proteínas reguladas pelo relógio biológico cuja atividade é preferencialmente mais acentuada no período diurno. Experimentos preliminares de nosso laboratório têm mostrado que diversas enzimas em G. polyedra , além de luciferase (resposável por sua bioluminescência), tais como nitrato redutase (NR) e superóxido dismutase oscilam suas atividades circadianamente. Desta alga, os pigmentos carotenóicos tais como peridinina e ß-caroteno, têm sido isolados, caracterizados e suas vias de biossíntese estudadas. Em paralelo estamos também utilizando como modelo de estudo a macroalga vermelha Gracilaria tenuistipitata a qual expressa circadianamente a enzima NR ( localizada em cloroplastos ) Informações moleculares a respeito da regulação circadiana destes sistemas, nos possibilitará avaliar como o relógio biológico atua no controle alternativo e/ou simultâneo de atividades periódicas distintas. Também teremos condições de envisionar a respeito da estrutura e componentes responsáveis pelo mecanismo do acerto temporal celular. Efeito da Poluição por Metais na Expressão de Proteínas em Algas Marinhas de Interesse Comercial. O objetivo a longo prazo deste projeto é elucidar, em algas marinhas, os mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares responsáveis pela resposta `a sua exposição a metais poluentes. Nossos experimentos têm mostrado que quando a alga marinha Gonyaulax polyedra é submetida a condições experimentais adversas tais como excesso de luminosidade, UV, presença de metais poluentes e solventes orgânicos, estas algas unicelulares respondem com a expressão exacerbada de várias enzimas e alterações nos níveis intracelulares de carotenóides. Entre as enzimas, a superóxido dismutase, a principal enzima responsável pelo controle endógeno de especies radicalares de oxigênio, é induzida em conjunto com outras enzimas do sistema relacionado ao chamado "stress oxidativo". Neste projeto abordaremos aspectos distintos da fisiologia celular, bioquímica e molecular de algas com interesse econômico como o dinoflagelado marinho G. polyedra (presente em marés vermelhas liberando toxinas) e as macroalgas marinhas Gracilaria tenuistipitata (fonte de ágar para empresas de biotecnologia) e Kappaphycus alvarezzi (fonte de carragenana para a indústria alimentícia). Em experimentos preliminares observamos, como dito anteriormente, que a presença de metais como Hg, Cd, Pb e Cu induzem simultaneamente o encistamento de G.polyedra e a indução da expressão de diversas proteínas. Portanto, parte deste projeto estará relacionado ao estudo detalhado dos efeitos de metais poluentes sobre o comportamento destas algas, assim como, seus efeitos sobre a indução da expressão de proteínas. Resultados deste projeto revelarão os possíveis mecanismos da expressão das enzimas responsáveis pela proteção celular contra adversidades ambientais, em especial a causada pela poluição, e a adaptação fisiológica (morfologia, funcionais ou bioquímicas) que favoreçam os processos vitais dos organismos. Atuais componentes do grupo: Pio Colepicolo: piocolep@iq.usp.br Teresa Kutner: tekutner@iq.usp.br Marcelo Paes de Barros: mpbarros@iq.usp.br Heloísa C. Hollnagel: hchollna@iq.usp.br Patricia de Fátima Lopes: patlopes@iq.usp.br Osvaldo Keith Okamoto: keith@iq.usp.br Alcely Strutz Barroso: asbarros@iq.usp.br Ernani Pinto Júnior: ernanipj@iq.usp.br Karina H. Morais Cardozo : kakatuca@zipmail.com.br Jaqueline Salotti: jsalotti@redealuno.usp.br Maíra Monteiro Marques: maíramm@hotmail.com Edanilson P. Carvalho: edpec@iq.usp.br Sandra R. de Souza Fundações que Pagam Nossos Projetos: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – Projeto Temático STINT – Stockholm, Sweden – Bolsas de Intercambio Brasil-Sweden CAPES – Bolsas de Pós Graduação CNPq – Projeto Integrado e Bolsas de Pós Graduação e Iniciação Científica International Foundation for Science (IFS) – Projeto de Pesquisa e Auxílios de Viagem National Institute of Health (NIH) – Bolsas de Intercâmbio nos USA. Literatura Selecionada: PIO COLEPICOLO, TILL ROENNENBERG, DAVID MORSE, WALTER R. TAYLOR & JOHN WOODLAND HASTINGS (1993). Circadian Regulation of Bioluminescence Light Production in the Dinoflagellate Pyrocystis lunula. Journal of Phycology, 29, 173-179. CAMILA BALSAMO RAMALHO, JOHN WOODLAND HASTINGS & PIO COLEPICOLO (1995). Circadian Expression of Nitrate Reductase in the Unicellular Algae Gonyaulax polyedra.. Plant Physiology, 107: 225-231. PAOLO DI-MASCIO, HELOISA CANDIA HOLNAGEL, MARCIA APARECIDA SPERANÇA, & PIO COLEPICOLO (1995). Diurnal Rhythm of Carotenoids in the Photosynthetic Algae Gonyaulax polyedra . Biological Chemistry Hoppe-Seyler, 376: 297-301. LAWRENCE FRITZ, CLAUDIA GADINNI STRINGER & PIO COLEPICOLO (1996). Imaging Oscillations in Gonyaulax: a Chloroplast Rhythm of nitrate reductase visualized by immunocytochemistry. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 29:111-118. OSWALDO KEITH OKAMOTO, CRISTINA SAYURI ASANO, ELISABETH AIDAR & PIO COLEPICOLO (1996). Effects of Cadmium on Growth and Superoxide Dismutase Activity of the Marine Microalga Tetraselmis gracilis (Prasinophyceae). Journal of Phycology.32: 74-79. LAWRENCE FRITZ, CLAUDIA GADINNI STRINGHER & PIO COLEPICOLO (1996). Immunolabeling of Nitrate Reductase in the Photosynthetic Dinoflagellate Gonyaulax polyedra.. Journal Phycology, 32: 632-637. NELSON MARQUES, CLAUDIA GADINNI STRINGHER, CRISTINA SAYURI ASANO & PIO COLEPICOLO (1997). Aspectos Moleculares e Celulares dos Ritmos Biológicos. Em: Cronobiologia: Principios e Aplicações (EDUSP, SP e EDITORA FIOCRUZ, RJ, Brasil). p 163-183 PATRICIA FATIMA LOPES, MARIANA CABRAL OLIVEIRA & PIO COLEPICOLO (1997). Circadian Fluctuation of Nitrate Reductase Activity in the Marine Red Alga Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta), Journal Phycology. 33, 225-231. CRISTINA SAYURI ASANO, OSWALDO KEITH OKAMOTO & PIO COLEPICOLO (1998). Diurnal patterns of incorporation of [d P32]- ATP in isolated chloroplosts from Gonyaulax polyedra. Biological Rhythm Research, 29: 488-493. OSWALDO KEITH OKAMOTO, LIMING SHAO, JOHN WOODLAND HASTINGS & PIO COLEPICOLO (1999). Acute and chronic effects of toxic metals on viability, encystment and bioluminescence in the dinoflagellateGonyaulax polyedra.. Comparative Biochemistry and Physiology. C Pharmacology Toxicology and Endocrinology,, 123, 75-83. DANIELA SANKIEVICS and PIO COLEPICOLO (1999), A New Member of the Leucyl Aminopeptidase Family Purified and Identified from a Marine Unicellular Algae. Biochemical and Biophysical Research Communications. 262, 557-561. ERNANI PINTO, PAOLO DIMASCIO, LUIZ HENRIQUE CATALANI and PIO COLEPICOLO (2000). ISOLATION OF PERIDININ FROM CHOROPLASTS OF Gonyaulax polyedra. Biochemical and Biophysical Research Communications. 268, 496-500